Menjelaskan Sifat Mikroba Endofit dengan singkat

1. Metodologi Isolasi mikroba endofit

Ranting tanaman dipotong sepanjang 1 cm. Untuk mensterilkan permukaan, potongan ranting direndam di dalam larutan Byclean atau Chlorox 5 % selama 5 menit, diikuti dengan perendaman dalam air steril selama 2 menit, entanol 70% selama 1 menit, dan air steril selama 2 menit. Potongan yang telah disterilkan dihilangkan ekses airnya dan selanjutnya dibelah menbujur menjadi 2 bagian. Inokulasi dilakukan dengan cara meletakkan permukaan belahan pada permukaan medium CMM (corn meal malt extract) agar untuk isolasi fungi atau Nutrien agar untuk isolasi bakteri. Inkubasi dilakukan selama 4-7 hari. Koloni mikrobia diisolasi dengan ose, selanjutnya isolat fungi dipelihara pada medium PDA miring dan isolat bakteri dipelihara pada Nutrien agar miring sebagai kultur stok murni.

2. Uji produksi

Dilakukan memakai medium Antibiotik-3 dan PGY, Nutrien, dan PD cair selama 4 -5 hari, inkubasi pada temperatur kamar, digojog 125 ketukan atau 150 rpm. Sel dipisahkan dengan sentrifugasi pada kecepatan 6000 rpm selama 15 menit. Supernatan dipisahkan dan disimpan pada temperatur dingin, dan selanjutnya dipakai untuk pengujian antimikrobia.
• Komposisi medium Antibiotik-3 (g/l: Beef extract 1,5, yeast extract 1,5, peptone 5,0, NaCl 3,5, dekstrosa 1,0, dipotassiumphosphate 3,65, dan monopotassiumphosphate 1,32 (Formula Difco Laboratory, USA) .
• Medium GY(Glyserol and Yeast extract) (g/l : gliserol 5, glukosa 3, polipepton 2, yeast extract 3, NaCl, dan CaCO3 ditambahkan sesudah pH diatur menjadi 6,0. Nutrien (Oxoid)
• PD (potato dextrose).

3. Seleksi jamur endofit penghasil antimikrobia (antibiotik)

Langkah pertama seleksi dilakukan dengan teknik “paper discdiffusion technique”, yakni dengan jalan mencelupkan paper disc ke dalam supernatant dan hindarkan ekses air. Paper disc yang sudah bebas ekses air diletakan pada medium yang mengandung mikrobia indikator Bacillus subtilis, Candida albicans, dan Fusariumoxysporum f.sp. licopersicae dan diinkubasi pada suhu kamar, selama 2 hari. Terbentuknya zone jernih di sekitar paper disc menggambarkan adanya aktivitas penghambatan oleh senyawa antimikrobia (antibiotik) terhadap mikroba indikator. Seleksi isolat dilakukan dengan mengkompilasi hasil uji ini. Isolat yang memiliki nilai rasio lebih besar 4 menjadi kandidat isolat unggul.

4. Identifikasi pendahuluan senyawa antimikrobia

Penetapan senyawa antimikrobia pada supernatant dilakukan teknik kromatografi kertas. Spotting supernatan pada kertas kromatografi sebanyak 20.mL dengan menggunakan micro syringe. Spot dikembang-kan dengan berbagai eluen yaitu eluen A (Ammoniumchloride 20 % dalam akuades), B (akuades yang dijenuhi butanol), C (butanol : asam asetat: air = 3:1:1), D (aseton : butanol : air (5 : 4 : 1) dan E (akuades yang dijenuhi asam asetat). Bercak kromatogram yang dihasilkan selanjutnya diidentifikasi dengan teknik “bioassay” dan menggunakan mikroba indikator.

5. Hasil Dan Pembahasan Isolasi jamur endofit dari beberapa spesies tanaman

Sampel tanaman diambil dari berbagai macam tanaman (25 spesies tanaman)
No Nama Tanaman Nama Ilmiah/ latin Kode Isolat Jmlh Fungi
1 Srikoyo/Kemulwo Annona squamosa KMW 4
2 Mimba Azadirachta indica MB 5
3 Kemuning Aglais odorata KMN 8
4 Mahkota dewa Phaleria macrocarpa MD 4
5 Kemiri Aleurites moluccana KMR 3
6 Sawobludru Diospiros rabola SB 5
7 Pelem Mangifera indica PLM 3
8 Kepel Stelechocarpus bulahol KPL _
9 Kakao Theobroma cacao KKO 5
10 Jambu air Syzygium aqueum/ S. javanica JA 2
11 Belimbing Averhoa carambola BLB 3
12 Kelengkeng Euphoria longana KLK 3
13 Preh/ Beringin Ficus benyamina PREH 1
14 Kayu putih Eucalypthus alba/smithii KYP 4
15 Nangka Artocarpus heterophyllus NGK 6
16 Kitiran Corypha utan KTR 4
17 Kelengkeng Caesalpinea crista KLK 3
18 Sirih Piper Piper betle SRH 3
19 Alpokat Persea gratissima/ americana APK 3
20 Salam Syzygium polyanthum SLM 3
21 Melati Jasminum sambas MLT 4
22 Sawo kecik Manikara kauki SK 3
23 Kenanga Cananga odorata KNG _
24 Jambu kluthuk Psidium guajava JKL _
25 Benalu(Kemladean) Loranthus parasiticus KMD 7
Total isolat fungi 86
Tabel I. Tanaman sumber dan jumlah isolat jamur endofit

Isolasi dilakukan menggunakan CMM (corn meal malt medium), yang dimodifikasi dengan penambahan pepton dan ekstrak khamir. Isolat yang tumbuh di sekitar ranting diisoslasi dan dikulltivasi pada medium PDA, serta disimpan dalam lemari pendingin.

Hasil isolasi jamur endofit (Tabel I). Isolasi dari tanaman Kepel, Arumdalu dan Jambu Kluthuk tidak diperoleh isolat, diduga karena sampel diambil dari bagian pucuk tanam/ ranting dan populasinya sangat sedikit. Sampel dari tanaman atau organ tanaman tua misalnya Benalu, Nangka, Belimbing, Kayu putih, Srikoyo, Pelem dan Kemuning dapat diisolasi banyak isolat, asumsinya pada belahan ranting sepanjang 1 cm dipenuhi oleh populasi mikroba sedangkan organ atau tanaman muda memiliki kondisi yang sebaliknya. Delapan puluh enam (86) isolat berhasil diisolasi dan selanjutnya diuji kemampuannya memproduksi metabolit sekunder/antibiotik yang mampu menghambat/membunuh mikroba, Bacillus subtilis. Candida albicans dan Fusariumoxysporum f. sp. licopersicae.
Produksi antibiotik dilakukan pada berbagai medium yang memberikan gambaran sumber karbon atau substrat spesifik sebagai pemicu/pemacu dalam metabolism substrat menjadi agensia antibiotik, diantaranya adalah PDB (potato dextrose broth), Antibiotik-3 dan GY (Glyserol and Yeast extract).

Petrini et al., (1992) melakukan skrining terhadap lebih dari 80 spora endofit dan menghasilkan 79 % spora fungi yang mampu menghasilkan antibiotik, selain itu Dreyffus (1992) dalam Petrini et al., (1992) berhasil mendapatkan fungi Cryptosporiopsis yang mampu menghasilkan antibiotik berspektrum lebar. Huang dan Kaneko (1996) melaporkan bahwa lebih dari 400 metabolit sekunder dihasilkan oleh kelompok fungi Pyrenomycetes dan Loculoascomycetes, dimana fungi endofit merupakan anggota kelompok fungi ini yang juga mampu menghasilkan antibiotik penghambat fungi dan bakteri. Martani, et al., (2002) berhasil mengisolasi 48 isolat jamur dari 19 tanaman dan 19 isolat diantaranya mampu memproduksi antibiotik, 39,5 %. Margino, et al., (2001) berhasil mengisolasi sebanyak 34 isolat penghasil antibiotik dari 44 isolat jamur endofit, 77, 3 %.

6. Seleksi berdasarkan cara bioassay produksi metabolit sekunder

Medium B. subtilis C. albicans F. oxysporum
PDB 11 1 1
Antibiotik-3 24 3 24
GY 12 16 17

Tabel II. Jumlah isolat penghasil antibiotik dalam medium PDB, Antibiotik-3 dan GY dan indicator Bacillus subtilis, Candida albicans, dan Fusarium oxyaporum f.sp. licopersicae

NO Medium Kode Isolat Produksi metabolit sekunder pada berbagai Medium dan daya hambatnya > 2,0
B. subtilis C. albicans F. oxysporum
1 PDB JA-2 5,5 _ _
2 APK-1 5,2 _ _
KMD-7 _ 7 3,5
3 Antibiotik-3 ANTIBIOTIK-3 MB- 1 _ _ 5,6
4 SB-3 5,2 _ _
5 KMN-3 4,2 _ _
6 JA-1 2,5 _ 4.2
7 NGK-1 5,2 _ 2,3
8 MLT-2 4,5 _ _
9 KMD- 7 4,1 3,5 _
10 GY GY SB- 4 3,5 _ _
11 KYP-2 4,1 _ _
12 SRH-3 3,4 _ 2,7
13 13 APK-2 _ _ 2,5

Tabel III. Produksi metabolit sekunder fungi endofit pada medium cair PDB, ANTIBIOTIK-3, dan GY, dan uji bioassainya dengan mikroba indikator Bacillus subtilis. Candida albicans dan Fusarium oxysporum f.sp.licopersicae

Potato Dextrose Broth (PDB) kurang dapat memicu produksi antibiotik baik yang mampu menghambat mikroba prokariot gram positif (B. subtilis) maupun eukariot (C. albicans dan Fusariumoxyaporum f.sp. licopersicae). Walaupun belum maksimal ketiga macam medium tersebut dapat dipakai untuk menjaring produksi antibiotik oleh isolat-isolat jamur endofit, dari 86 isolat khususnya medium Antibiotik-3 merupakan substrat terbaik untuk memproduksi antibiotik penghambat B. subtilis demikian halnya dengan daya hambat yang dihasilkan di atas rata-rata daya hambatnya bila dibandingkan dengan PDB dan GY Tabel II. Namun demikian medium GY memberikan hasil terbanyak walau bukan terbaik untuk memproduksi antibiotik penghambat C. albicans dengan jumlah 16 isolat dan F. oxysporum sebanyak 17 isolat

Hitungan prosentase penjaringan isolat jamur endofit menggunakan medium GY sebanyak 45/86..x..100.% = 52,33.%, medium Antibiotik-3 sebanyak 42/86 x 100 % = 48,84 %, dan medium PDB sebanyak 13/86x 100 % = 15,16 %, (Tabel II).

Isolat-isolat unggul hasil seleksi atas dasar daya hambat antibiotik terhadap berbagai mikrobia indikator disajikan pada Tabel III, tabel ini memberikan gambaran yang lebih mantap kaitannya rencana aplikasi produksi antibiotik di kemudian hari sesuai dengan pengembangan jenis jamur dan kualitas dan kuantitas produksi antibiotiknya. Oleh karena itu, karakterisasi atau identifikasi pendahuluan senyawa antibiotik dilakukan terhadap beberapa isolat yang memiliki potensi pengembangan di kemudian hari.

Bioassay sampai tahap penetapan seleksi menggunakan indikator B.subtilis, C.albicans, dan F.oxysporum. Hasil penelitian menunjukkan bahwa sangat sedikit isolat yang mampu menghambat C. albicans, dengan diameter 7-10 mm sedangkan paper disc yang dipakai berdiameter 6 mm. Hasil penghambatan terhadap B. subtilis yang memiliki diameter penghambatan lebih dari 2 sebanyak 15 isolat dan 9 isolat memiliki diameter penghambatan sama dengan atau lebih dari 40 mm, Tabel III. Tiga isolat unggul dalam aplikasinya di bidang pertanian maupun kesehatan manusia, JA-2 memiliki nisbah daya hambat sebesar 5,5 terhadap Bacillus subtilis, MB-1 memiliki daya hambat sebesar 5,6 terhadap Fusariumoxysporum, dan KMD-7 memiliki daya hambat 4,1 terhadap B. subtilis dan daya hambat 3,5 terhadap C. albicans. Yulianah, dkk. (1987) melaporkan bahwa medium yang mengandung glukosa 1,0% dan yeast extract 0,25..% dapat dipakai oleh Streptomyces indonesiensis ATCC 35859 untuk meningkatkan produksi antibiotik (antifungi) berspektrum luas. Cheeptam (1999) melaporkan bahwa medium yang mengandung gliserol dapat meningkatkan produksi antibiotik (anti fungi/bakteri), dan dalam penelitiannya produksi antibiotik mencapai maksimal menggunakan Ellishiodothis inquinans L1588-A8 dalam medium yang mengandung gliserol 5,0.% dan yeast extract 0,4.%.

Antibiotik banyak dihasilkan oleh isolat yang ditumbuhkan pada medium yang mengandung F-4 dan GY, selain mengadung senyawa kompleks (tepung kedelai pada medium F-4), juga banyak mengandung gliserol. Dalam proses metabolisme mikroba pada umumnya gliserol dan glukosa diubah menjadi asam piruvat lewat pathway glikolisa dan acetil-KoA yang dibutuhkan dalam siklus asam trikarboksilat (TCA cycle) untuk proses respirasi. Glukosa dan gliserol merupakan substrat penting dalam pertumbuhan dan biosintesis penghasilan metabolit sekunder, termasuk antibiotik (Cheeptam, 1999). Peneliti lain, Margino, et al., (2001) menunjukkan bahwa banyak antifungi diproduksi pada medium F-4 dan GY dibandingkan PDY, yakni hampir 40% medium F-4 dab GY mampu memacu produksi antifungi yang menghambat Alternaria sp. Hasil karakterisasi senyawa antibiotik dengan teknik kromatografi dilakukan dengan berbagai eluenseperti Ammonium Klorida 20% ; Air dijenuhi Butanol ;  Butanol: Asam asetat : Air (3:1:1) ; Aseton:Butanol:Air (5:4:1) ; Air dijenuhi Asam asetat ; Sampel ditotolkan sebanyak 20 ML.

Teknik kromatografi ini berbasis pada tingkat polaritas senyawa antibiotik dan berapa macam senyawa yang dikandung dalam larutan ektraseluler jamur endofit sesudah ditumbuhkan di berbagai medium. Perbedaan nilai Rf sebagai kunci macam dan jumlah senyawa antibiotik yang bersangkutan. Salah satu sifat fisik antibiotik terhadap pengaruh eluen adalah angka polaritasnya, sehingga polaritas pelarut atau eluen menentukan jarak pergerakan ‘bercak’ dari tempat totolan mencapai jarak tertentu, nilai ini selanjutnya dikenal sebagai retardation force (Rf) sesudah dibandingkan dengan jarak dimana titik elusi diakhiri.

Tabel IV. Nilai Rf antibiotik yang dielusi dengan eluen B,C,D, dan E, Mikroba indikator B. subtilis, C. albicans,dan F. oxysporum f.sp. licopersicae

No Isolat Mikroba Indikator Nilai RF dari eluen
A B C D E
1 NGK-1 B. Subtilis _ _ 0,75 _ 0,80
2 SB-3 B. Subtilis _ _ 0.3 _ _
3 JA-2 B. Subtilis _ _ 0,91 _ _
4 KMN-3 B. Subtilis _ 0,21 ; 0,94 _ _ _
5 MLT-2 B. Subtilis _ 0,85 _ _ _
6 APK-1 B. Subtilis _ 0,34 ; 0,93 _ _ _
7 KYP-2 B. Subtilis _ 0,74 _ 0,30 _
8 KMD-7 C. albicans _ _ _ _ _
KMD-7 B. Subtilis _ 0,48 0,78 _ _
9 MB-1 F. oxysporum _ _ _ _ _

Ket : A : Ammonium Klorida 20% ; B: Air dijenuhi Butanol ; C: Butanol: Asam asetat : Air (3:1:1) D: Aseton:Butanol:Air (5:4:1) ; E: Air dijenuhi Asam asetat ; Sampel ditotolkan sebanyak 20 ML

Antibiotik yang dihasilkan oleh NGK-1 memiliki nilai Rf : 0,75 setelah dielusi dengan Butanol:Asetat :Air (3 :1 :1) dan nilai Rf :0,80 pada eluen Air dijenuhi Asetat, dengan perkataan lain bahwa untuk pemanenan antibiotik tersebut dapat mempergunakan campuran pelarut tersebut setelah proses produksi secara fermentasi.Demikian halnya dengan isolat SB-3 dan JA-2 berturut memiliki nilai Rf : 0,30 dan 0,91 pada eluen Butanol:Asetat :Air (3 :1 :1). Isolat KMD- 7 mampu memproduksi antibiotik penghambat C. albicans namun nilai Rf nya belum diketahui menggunakan kelima jenis eluen tersebut sehingga tidak muncul pada percobaan ini.

Isolat APK-1 memproduksi 2 macam antibiotik yang menghambat B. subtilis dan memiliki nilai Rf berturut-turut 0,34 dan 0,93 bila dielusi dengan eluen air yang dijenuhi butanol, demikian halnya isolat KMN-3 memiliki 2 macam antibiotik dengan nilai Rf 0,21 dan 0,94 apabila sampel dielusi dengan air yang dijenuhi butanol. Antibiotik yang diproduksi oleh isolatKMN-3, MLT-2, APK-1, KYP-2, dan KMD-7 dan menghambat B. subtilis memiliki polaritas sejenis walau secara rinci nilai Rf mereka mayoritas berbeda tetapi antibiotik KMN-3 dan APK-1 ada yang mirip karena nilai Rf mereka 0,93 dan 0,94, dimungkinkan antibiotik ini jenis dan bahan aktifnya sama. Beberapa antibiotik seperti penisilin, rosamisin, dan sefalosporin C, N dan P dapat diidentifikasi dengan menggunakan pelarut butanol: asam acetat: air (3:1:1). Sebagai pembanding diketahui bahwa rosamisin memiliki nilai Rf : 0,31; 0,37 dan 0,44 , sedangkan sefalosporin N dengan perbandingan pelarut (eluen) butanol : asam acetat : air (12:3:5) memiliki nilai Rf: 0,38.

Perbandingan hasil uji bioassai isolat MB-1 memiliki daya hambat terhadap F. oxysporum dan KMD-7 memiliki daya hambat terhadap C. albicans namun setelah dielusi menggunakan kelima eluen masih belum ditemukan ‘spot ‘ yang memberikan penghambatan terhadap mikroba indikator tersebut. Oleh karena itu, optimasi produksi hanya dapat dilakukan terhadap isolat JA-2 dan NGK-1, dimana JA-2 memiliki daya hambat 5,5 terhadap B. subtilis bila ditumbuhkan pada medium PDB dan NGK-1 memiliki daya hambat 5,2 terhadap B.subtilis dan 2,3 terhadap F.oxysporum bila ditumbuhkan pada medium Antibiotik-3, namun demikian daya hambat NGK-1 tidak sebesar MB-1 terhadap F. oxysporum, yakni 5,6.

Untuk mendapatkan hasil yang optimal, seleksi dilakukan berdasarkan nilai daya hambat antibiotik terhadap mikroba indikator dan rencana aplikasinya di sector pertanian dan kesehatan. Sektor pertanian diwakili oleh Fusariumoxysporum dan sector kesehatan diwakili oleh Bacillus subtilis dan Candida albicans, oleh karena itu dari Tabel III dapat dipilih berturut-turut JA-2 dan NGK-1 sebagai isolat unggul yang memiliki prospek bagus dalam aplikasi di lapangan atau skala fabrikasi setelah melewati serangkaian penelitian lanjutan dan sampai ke tahapan pemurnian dan aplikasi.

Tabel V. Kondisi optimum pertumbuhan dan produksi antibiotik NGK-1 dan JA-2

Isolat pH Agitsi (rpm) Aetasi (mL/mnt) Substrat (%) Temperatur °C Karbon (Gliserol, g/L)
NGK-1 6,5 125 rpm 2500 5 30 5
JA-2 6,0 150 rpm 3000 5 30 7,5

Hasil optimasi faktor lingkungan untuk pertumbuhan dan produksi antibiotik isolate JA-2 dan NGK-1 (Tabel V). Kondisi optimasi yang disajikan pada Tabel V menghasilkan daya hambat terhadap mikroba indikator B. subtilis. Hasil optimasi menunjukkan bahwa produksi antibiotik dicapai sesudah jam ke 60 baik oleh isolat JA-2 dan NGK-1 dengan nilai penghambatan berkisar 7,0 walau fase lag mereka sedikit berbeda dimana JA-2 sampai jam ke 24 sedangkan NGK-1 jam ke 12-an. Data pertumbuhan tidak disajikan karena analisa N total terkendala oleh alat namun demikian Gambar dapat memberikan ilustrasi kemampuan isolat yang bersangkutan menghambat mikroba indikator atau aplikasi di kemudian hari. Optimalisasi ini mampu meningkatkan daya hambat/ bunuh antibiotic isolat JA-2 dari 5,5 menjadi 6,9 dan isolate NGK-1 daya hambat/bunuh meningkat dari 5,2 menjadi 7,3.